锐赛生物
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酶活动力学检测

enzyme activity



活性的测定方


按照对酶促反应时间的选择不同分为:固定世间法、连续监测法

①固定世间法:测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。优点:简单 缺点:难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。

②连续检测法:测定底物或产物随时间的变化量,又称为速率法。优点:能动态观测酶促反应进程,可以明显找到反应的线性期,结果准确可靠,标本和试剂用量少,可在较短时间内完成测定。缺点:对环境要求高,要求能够精确地控制温度,PH值和底物浓度等反应条件,要求仪器具有恒温装置及自动检测功能。


酶活性测定的原理


直接测定反应生成物,酶促反应速率及其测定——以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。


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酶活性测定方法


常见的酶活性检测方法有:耦合反应、化学测定法、放射同位素法、测压法、电极法、HPLC法等。

影响酶活性试验的因素

①酶浓度

一般将底物过量,使酶可以充分与底物结合并发挥其催化功能。

②底物、辅因子的种类和浓度

1. 选合适的底物种类和浓度:

如所测的酶专一性不强,可作用于多种底物,首先就需决定选择哪一类底物作为测此酶的底物。确定底物种类后,重要的问题是选择底物的合适浓度。

2. 辅因子、活化剂的种类和浓度:

从广义上说,凡能促进酶及反应物进入活化状态从而加速酶催化反应的物质都能称为辅因子,它包括种类很广的物质。

③反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度

在酶反应的其它条件不变的情况下,在不同pH下可得各种类型的酶活性与pH关系,将酶活性最高处的pH称为最适pH 。

缓冲液含有大量离子,或影响酶蛋白的构型,或影响底物的解离程度等等,从而影响酶活性。

④温度的控制

测定酶时都需要酶和底物在一定温度下作用一段时间,在此期间,温度有可能使酶失活,不同酶在此方面差异很大,目前常规工作实验室越来越多的使用37℃,温度升高,反应速度快,灵敏度高。

不论选用何种温度测酶,由于酶反应受温度影响很大,在测定时间内,反应体系的温度变化应控制在±0.1℃内。应用国产普通恒温水浴箱来测酶活性是不合适的,应使用带有搅拌器的高级恒温水浴。

⑤其它影响酶活性因素

其它因素中,对酶活性测定而言,最重要的是抑制剂的作用。


酶活性检测实验设计和注意事项


平行试验:酶活性测定中,为了消除系统和操作误差,每次测定都要设置正常、异常对照,待测样品设置双份,取结果的平均值,并综合本实验室的正常值、对照管的结果。常常用容易失活的酶作参考酶同时测定,只有当参考酶活性正常时才能肯定所得结果可靠,排除假阳性。

防止酶失活:这是实验稳定、成功的关键。细胞分离、超声粉碎、离心等操作都要在4°C条件下进行,标本采集后要立即进行处理。


酶活性检测实验结果展示


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酶活性测定反应终止方法


①改变PH值使蛋白质变性沉淀

②急热100度

③用1%SDS中止反应,注意protease K等在SDS下仍有活性。

④金属离子参与反应的,可加入EDTA

⑤加入抑制剂

⑥放射法测定时可加入大量非放射性基质

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