锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

流式凋亡检测

apoptosis detection



实验原理


细胞凋亡(Cell apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下的损伤,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

细胞凋亡检测的方法很多,我们采用的Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡的原理:磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行EGFP融合、荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针。(如下图7.4所示)。


7.4 Annexinv检测细胞凋亡的原理


碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但可进入凋亡中晚期的细胞和死细胞,而使细胞核红染。Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡,可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及死细胞区分开。


技术应用


细胞凋亡研究不仅受到基础医学界的重视,也日益受到临床医学领域的青睐。通过检测药物、基因或蛋白对细胞凋亡及凋亡调控基因的影响,在肿瘤防治、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都发挥着积极的作用。


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

细胞株(冻存株或培养细胞)

及所需药品

细胞培养信息和药物处理方式

3周

我们提供

剩余药物

基本实验步骤、细胞培养照片、

流式上机图片、数据分析结果


实验结果展示


图1 采用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡


TROUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

空白细胞凋亡率高?

操作不当

操作动作轻柔,收完样后尽快上机。

检测试剂量过大,信号过强

降低试剂用量。

采用Annexin V/PI双染

法检测凋亡诱导后的阳

性对照样本凋亡率偏低?

试剂盒过期

4℃保存时间不要超过半年。

荧光淬灭

操作过程中注意避光,加完染料之后最后在2h内检测。

丢弃细胞培养上清

细胞培养上清中含有漂浮细胞,丢弃后造成凋亡比例偏低。


常见问题FAQ


Q :常用的细胞凋亡的检测种类有哪些?

A :凋亡检测方法有数十种之多,主要可以分为以下几大类: 1) DNA水平,检测凋亡时基因组DNA的变化; 2)蛋白水平,主要检测凋亡时线粒体和死亡受体两大凋亡通路的变化; 3)细胞膜/细胞器膜水平,主要检测凋亡时细胞膜成分或者膜电位的变化; 4)超微结构,主要检测凋亡时亚细胞结构的变化。这些方法各有优缺点,必须结合具体的实验目的,实验条件以及实验处理来选择合适的分析手段。


Q :常见的细胞亡检测方法及优缺点比较?

方法

优点

缺点

Anexin VPI双染法:

Annexin v可结合凋亡细胞外翻的PS

蛋白。

可以准确的进行凋亡细胞的计数。

反应完毕后需在一小时内检测,贴壁细胞吹打处理要轻柔,防止机械损伤对实验结果的影响。不能用于组织样本。

Sub G1 峰检测:

凋亡细胞DNA含量的流式细胞计划分析,分析DBA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。

适用性广,操作方便。

对实验操作及实验结果的分析能力要求较高。不能用于组织样本。

TUNRL法:

染色体DNA双链断裂或单链断裂而产

生大量的粘性3‘ -OH末端,可在脱氧

核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用

下,对DNA的3’ 末端进行荧光剂标记。

原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,特别适用于组织样本的凋亡研究。

操作要求高,组织样本需要固定,固定方式不好可能导致背景高、信号弱。

Caspase等凋亡通路蛋白的WB检测:未活化前以酶原形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段被剪切激活,可裂解相应的胞浆、胞核底物,最终导致细胞凋亡。

WB检测方便快捷,实验结果相对直观,可进行半定量检测。

注意购买质量好的抗体并优化检测条件。


Q: Annexin V/PI双染实验的四个象限分别代表什么?


PI

Annexin V

代表细胞群

LL象限

-

-

正常细胞

LR象限

-

+

早期凋亡细胞

UR象限

+

+

晚期凋亡细胞或者坏事细胞


UL象限

+

-

理论上不会出现细胞;若出现有可能是操作过程中受到损害的细胞或是FACS仪器参数设置不当


A:根据费光情况划分四个象限(见图7.6) ,横坐标代表绿色光(Annexin V为FITC绿色光标记),纵坐标代表Pl红色荧光,四个象限分别命名为LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿过未凋亡细胞和凋亡早期细胞的细胞膜,而Annexin V可以检测到凋亡早期外翻的PS,因此四个象限代表了不同的细胞群。

图片1.png

图7.6流式四象限图


Q:流式上机检测细胞亡每次所需要的细胞量大概是多少?

A:细胞接种到6孔板中进行前期药物处理/转染/感染后备用。对于个体比较大的细胞,依据实际细胞密度,使用150pxt培养血培养细胞,最终进行检测需10^5-10^6个细胞。


参考文献

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.

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