锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

CCK-8检测

CCK-8gauging



实验原理


CCK-8(Cell Counting kit-8)试剂中含有WST–8:化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐],它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan),生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,可采用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,间接反映活细胞数量。


技术应用


该方法已被广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增值实验(1-6天)、细胞毒性实验、药物敏感度实验、细胞基质黏附实验等。


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

细胞株(冻存株或培养细胞)

及处理用的药物

细胞培养信息和药物处理方式

3周

我们提供

剩余药物

基本实验步骤、细胞培养照片、CCK-8吸光度值的数据表,柱状图或生长曲线


实验结果展示


图1CCK-8法检测待测细胞靶基因经RNA干扰后1-6天的增殖情况


TROUBLSHOOTING


实验问题

原因

推荐解决方法

吸光度值过低?

细胞数量过低

增加待测细胞数量。

染色难度大

延长CCK-8试剂的孵育时间。

CCK-8数据重复性差

使用外圈容易挥发的孔

最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。

CCK-8沾壁

加入CCK-8后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。

细胞数量过多或过少

预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

孔内气泡干扰酶标仪检测

检测前需确保每个孔内无气泡。


常见问题FAQ


Q : CCK-8试剂盒检测细胞增殖和毒性的优点有哪些?

A : CCK-8较传统的MTT法优点在于1) MTT被线粒体内的一些脱氢还原酶还原成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解,而CCK-8产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤; 2) CCK-8检测灵敏度更高,更加稳定; 3)酚红和血清对其测定无明显影响; 4)不必去上清,不必洗,涤细胞,更加简便; 5)对细胞无明显毒性,加入显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读板,使检测时间更加灵活,而且不影响细胞进行后续实验。


Q :在做细胞的加药实验时,药物对CCK-8测定是否有影响?如何解决?

A :1)注意如果药物具有还原性(如维生素C),会CCK-8发生显色反应,增加吸光度。2)药物中的金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1mM的氯化亚铅、氧化铁、硫酸铜会抑制5%,15%, 90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10mM的话将会100%抑制。解决办法:首先要确认药物是否有吸收,在含有药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含药物的培养(加CCK-8)的吸光度高,则证明药物有影响,可在加CCK-8之前更换培养基,去掉药物的影响。3)由于培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验,建议使用一个孔作一下检测,有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常的0D值应该0.4以下。


Q : CCK-8如何设定空白对照?

A :在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。


Q : CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样?

A :不一样,悬浮细胞较贴壁细胞难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。


Q :可否采用CCK-8法进行肿瘤细胞的基质黏附实验?

A :可以,以层粘连蛋白(Ln)包被96孔板,通过计算不同时间点孔板中贴壁细胞的数量反映细胞的黏附性。细胞的黏附性越强,则单位时间内贴于铺有Ln板底的细胞数量越多,去除尚未贴壁的细胞后,应用CCK-8等方法计量细胞数量便可间接反映不同细胞或不同处理的细胞黏附能力的差异。


Q :可否采用CCK-8法进行药物的IC50检测?

A :可以,将细胞培养后按照不同浓度的药物处理-定时间后进行CCK-8检测,根据吸光度绘制曲线,计算该药物抑制细胞数量一半时的浓度(IC50)。


参考文献

1. Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, et al. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as a chromogenicindicator for NADH as well as cell viability. Talanta 1997,44(7): 1299-1305.

2. Ishiyama M, Tominaga H, Shiga M, et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicity with a highlywater-soluble tetrazolium salt, neutral red and crystal violet.Biol Pharm Bull 1996,19(11):1518-1520.

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