锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

酶联免疫吸附测定

ELISA



实验原理


酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。基本原理是:1)使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。2)使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高,故可放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。


在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应,再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应底物后,底物被酶催化为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据反应后颜色的深浅进行定性或定量分析(见图4.7)。


图4.7 ELISA检测原理示意图


实验流程


E流程.jpg



实物

数据信息

实验周期

客户提供

样本、ELISA试剂盒

ELISA试剂盒说明书

2周及以上

我们提供

剩余试剂盒

基本实验步骤、EXCEL原始数据、标准曲线



实验结果展示


结果.jpgConecntrations

图4.8ELISA标准曲线


表4.1五组样本目的蛋白ELISA吸光度值及浓度



OD1

OD2

OD3

平均值

C(pg/ml)

1

0.761

0.763

0.762

0.762

136.80

2

0.631

0.633

0.635

0.663

130.71

3

0.704

0.702

0.701

0.702

144.11

4

0.903

0.904

0.901

0.903

144.17

5

0.623

0.618

0.621

0.621

117.45



TROUBLESHOOTING


实验问题

原因

推荐解决方法

实验重复性不佳?

操作重复性不佳

同一人员重复操作,注意将样本充分混匀,保证加样量一致,其他操作过程如孵育时间,洗板条件保持一致。

加样孔显色过深?

洗涤不充分

充分洗涤,彻底拍干。

加样时间过长

合理安排工作量,样本量多要控制好加样速度或分批操作。

孵育温度过高

采用合适的温度。

孵育时间过长

注意减少孵育时间。

加样孔显色过浅?

试剂盒未充分平衡

4℃冰箱取出试剂盒后于室温平衡至20分钟

洗板时冲击力太大

注意调整洗涤时间和洗涤次数。

底物作用时间不足

注意准确定时。

样本浓度稀释过大

预实验摸索样本稀释浓度。

加样孔包括标准品加样孔都未显色?

显色液过期

更换新的ELISA试剂盒

使用错误的试剂

漏加酶结合物或者错误的使用终止液提前终止了反应。



常见问题FAQ


Q:ELISA 试 剂 盒 主 要 有 哪 些 试 剂 ?

A:ELISA 试剂盒中主要有

1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);

2)酶标记的抗原或抗体(结合物);

3)酶的底物;

4)标准品

5)结合物及标本的稀释液;

6)洗涤液;

7)酶反应终止液。

Q:造成ELISA实验结果不正常的因素有哪些?

A:造成ELISA测定结果不正常的因素主要有:

1标本因素:样本需新鲜采集,防止污染,且准确稀释至适当的倍数。

2)试剂因素:ELISA试剂盒在保质期内,其他试剂如蒸馏水的水质等。

3)操作因素:注意操作细节,如加样不可太快,避免加在孔壁上;洗板过程中注意洗液不能溢出孔外;显色要注意控制时间等。


Q:如何准备需要进行ELISA检测的细胞样本?

A:检测细胞分泌性成份时:用无菌管收集细胞培养上清,离心20分钟(2000-3000转/ 分)

取上清检测。检测细胞内成份时:收集细胞,用PBS(pH7.2-7.4)稀释细胞浓度至 106/ml左右,通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂,使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟(2000-3000 转 / 分),收集上清。保存过程中如有沉淀形成,需再次离心。


Q:ELISA 试剂盒(96 孔规格)一般可以进行多少个样本的检测?

A:标准品孔和待测样本孔需进行复孔操作以保证数据的可信度。每次需将标准品按照7-8个梯度稀释以制备准确的标准曲线。一次96孔板实验可以进行20-25个样本的检测工作。

Q:ELISA 的检测数据如何进行处理?

A:1)将得到的各个复孔浓度的吸光度值计算平均值。

2)按照横坐标为梯度稀释的标准品浓度,纵坐标为吸光度值做散点图,添加趋势线,利用多项式回归分析计算由以上数据产生的公式R2 值(R2 值越接近1说明线性关系越好)。

3)根据公式及待测样本的平均吸光度值计算样本中目的蛋白的浓度。


Q:常用的免疫学检测方法ELISAWB的区分有哪些


区分项目

ELISA

WB

目的

不仅可以检测抗原还可以检测抗体,对其进行定性和定量分析。

定性分析,对胶片灰度值进行半定量分析。

抗体识别位点

线性化或构象型位点均可。

线性化位点。

优点

96 孔板可以处理多个样本,通过设置复孔,对照,梯度可提高数据的可信度,且灵敏度高于WB

可明确蛋白的分子量大小,以及是否为多聚体或发生降解。

缺点

如果抗体有非特异性结合,得到的数值则不可信。

一次电泳最多处理10-20 个样本。


参考文献

1. J.R. Crowther. The ELISA Guidebook. Hunana Preaa,2001.

2. J.R. Crowther. ELISA:Theory and Practice.Humana Press,1995.

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