锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

miRNA的表达载体构建

vector construction



实验原理


miRNA是在真核生物中发现的具有调控功能的内源性非编码RNA,大小约20~25个核苷酸。我们根据成熟miRNA序列信息,合成含有茎环结构的前体miRNA连接至含侧翼序列的表达载体中(见图6.1),将其转染/病毒包装感染进入细胞后,由II型启动子(CMV)启动表达,经核酸酶的剪切加工,组装RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。


图片4.png

图6.1miRNA表达载体示意图


技术应用


通过过表达miRNA研究其功能并进行靶点筛选的后期研究工作


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

miRNA序列信息

10周

我们提供

miRNA表达质粒/菌株、病毒液

基本实验步骤、测序报告



实验结果展示

图1 miRNA 慢病毒包装实验结果
A:miRNA 慢病毒表达载体测序结果;B:miRNA 慢病毒感染 293 细胞照片。


TROUBLESHOOTING


实验问题

原因

推荐解决方法

miRNA过表达质粒构建过程中未能筛选到阳性克隆?

试剂问题

注意OIigo片段的纯化级别、退火buffer、连接酶体系、感受态细胞的效率等。

miRNA过表达质粒测序失败?

发夹结构影响测序

更换技术能力更好的测序公司。

miRNA过表达质粒对细胞转染效率低?

转染条件不佳

采用适合该细胞的转染试剂,优化转染条件。

细胞本身难转染

采用病毒介导miRNA的过表达。


常见问题FAQ


Q :为什么选择贵公司进行miRNA的表达载体构建工作?

A我们提供miRNA表达载体构建,可以在每一步操作为您把关:Oligo片段经PAGE纯化,质量优良,保证无碱基突变的情况;在载体构建以及测序验证过程中操作经验丰富,可以快速为您构建好所需的miRNA表达载体。


Q:什么是miRNA mimics, miRNA inhibitor?其应用有哪些?

AmiRNA mimics:运用化学合成的方法,模拟生物体内源的miRNA,特异性增强内源型miRNA的功能。

miRNA inhibitor:化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂,可特异高效的抑制生物体内源性miRNA的活性。

以上化学合成片段获取方便快捷,短时间内可以转染细胞,增加或抑制miRNA的活性,检测miRNA所调节的基因表达和对信号通路的影响,对阐明miRNA在诸如细胞发育、增值、分化和凋亡中的机理有重要意义。


Q:miRNA表达载体相对化学合成的miRNA mimics的优势有哪些?

AmiRNA表达载体相对化学合成miRNA可以进行质粒扩增、抽提,转染细胞或包装慢病毒感染细胞后,表达时长高于miRNA mimics,并且后续可以进行稳转株的构建工作;另外miRNA表达载体含GFP荧光标记,表达荧光更加稳定,方便进行转染或感染后的示踪。


参考文献

1. Ambros V.MicroR NAs: Tiny R egulators with Great Potential. Cell 2001;107(7):823-826.

2. Ambros V.The functions of animal micro R NAs.Nature 2004;431(7006):350-355.

3. Bartel DP.MicroR NAs:genomics,biogenesis, mechanism, and function.Cell 2004;116(2):281-297.

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