锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

RNAi病毒包装及筛选

package virus



实验原理


与化学合成的siRNA和shRNA质粒载体相比,利用慢病毒或腺病毒表达shRNA,一方面可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞,提高shRNA导入细胞的效率,另一方面病毒介导可延长RNAi的时间,尤其慢病毒感染后可以整合到宿主细胞基因组,进行稳转筛选。

图2.4慢病毒介导RNAi原理示意图


技术应用


技术应用基因功能的体内外研究

病理机制研究


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

靶细胞

目的基因NCBI登陆号,细胞培养信息

11-12周

我们提供

RNAi载体/菌株 

基本实验步骤,细胞照片,病毒包装实验报告、RNAi筛选实验报告


实验结果展示


图 1 相对定量 PCR 检测 3 组 shRNA 慢病毒感染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果


TPOUBLESHOOTING


实验问题

原因

推荐解决方法

干扰病毒感染靶细胞后qPCR干扰效果不佳?

感染效率低

确定细胞状态良好;采用合适的病毒MOI值,感染效率80%以上。

干扰病毒感染后对细胞毒性较大?

靶基因的功能

阴性对照病毒如果对细胞毒性无影响则说明靶基因的功能对细胞的增值是必需的。

干扰病毒感染后的稳转株构建失败?

靶基因的功能

如果阴性对照稳转株可以构建成功说明靶基因的功能对细胞的增值是必需的。



常见问题 FAQ


Q:化学合成siRNA,shRNA质粒和shRNA病毒进行细胞实验的优缺点?

常见的 RNAi 载体 / 方法

优点

缺点

化学合成 siRNA 转染细胞

化学合成方便快捷,周期短。可以进行动物体内实验研究。

干扰效果容易受到细胞转染效率影响;siRNA 很快被细胞外排扰效果保持的时间不能超过3天。

shRNA 质粒转染细胞

载体构建方便,可以进行扩增,避免了 RNA 操作中的特殊求,且质粒载体上可以带有EGFP 荧光标记和筛选标记。

很多肿瘤、原代细胞转染效率很低,不能得到很好的干扰效果。

shRNA病毒感染细胞

通过慢 / 腺病毒介导可以有效感染靶细胞 80% 以上,干扰效果达到70% 以上。其中慢病毒介导的shRNA 能整合入靶细胞的基因组中,可进行稳定株筛选工作。

病毒包装的费用相对 siRNA 和shRNA 有所提高,包装周期要长 siRNA 合成及 shRNA 载体构建。


Q:我提供靶细胞为什么需进行预实验?需检测哪些内容?

A客户提供的靶细胞进行培养后确定其状态,我们会进行靶基因的表达丰度检测,确认靶基因的表达量,然后采用慢病毒或腺病毒进行细胞的 MOI 值摸索,确认靶细胞用何种病毒预计采用多大的病毒量进行感染实验。若预实验结果表明细胞中靶基因的本底表达本身很低则不建议进行干扰筛选工作。


Q :病毒介导的RNAi筛选工作公司作何保证?

A:首先预实验摸索客户提供靶细胞的 MOI 值,感染效率达到 80% 以上,从而确定病毒的包装类型。然后设计三个干扰靶点并进行病毒包装工作,感染靶细胞后,我们通过 qPCR 检测,确保至少一个靶点的干扰效果大于80%。实验结束后最佳干扰靶点的腺病毒可根据客户的要求进行扩增;最佳干扰靶点的慢病毒可以根据客户的要求大量包装后提供给客户。


参考文献

1. Buchschacher GL Jr, Wong-staal F. Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseases.Blood2000,95(8):2499-2504.

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