锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

shRNA载体构建及筛选

ShRNA carrier



实验原理


早期的shRNA载体多采用RNA聚合酶III型启动子介导shRNA的表达,RNA聚合酶III型启动子如鼠源的U6启动子和人源的H1启动子可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。随着miRNA干扰机制的深入研究,发展出第二代siRNA载体,即采用RNA聚合酶II型启动子CMV表达含侧翼序列的miRNA模拟物(见图2.2)。该载体模拟miRNA的加工,表达出来的shRNA进入RISC沉默复合物的效率要比RNA聚合酶III型启动子表达的shRNA高倍十倍,抑制效率更好,且可以和EGP协调表达,方便观察转染效率。


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图2.2RNA聚合酶II型启动子pRS/CMV/miR图谱


技术应用


基因功能的体内外研究

病理机制研究


实验流程


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实物

数据信息

实验周期

客户提供

目的基因NCBI登录号

6周

我们提供

shRNA载体/菌株

基本实验步骤、细胞照片、

qPCR原始数据,扩增曲线,溶解曲线



实验结果展示


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图2.3相对定量PCR检测4组shRNA转染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果



TROUBLESHOOTLNG


实验问题

原因

推荐解决方法


shRNA转染靶细胞后qPCR检测干扰效果不佳?

转染效率低

保证细胞状态,选择合适的转染试剂,转染效率要求在80%以上,难以达到要求考虑用慢病毒或腺病毒介导。

转染条件不佳

调整shRNA质粒与转染试剂的比例。

本底表达丰度过低

本底表达丰度过低干扰效果会很不明显。


shRNA转染靶细胞后WB检测干扰效果不佳?


靶蛋白的稳定性较强

延长干扰时间可改用病毒介导或进行稳转筛选。

使用文献提供靶点无干扰效果?

实验无法重复文献结果

建议重新设计4个干扰靶点进行最佳靶点的筛选工作。



常见问题 FAQ


QsiRNA,miRNA以及shRNA如何区分?

名称

特点

   siRNA(双链小片段RNA)

在RNAi通路中起作用,干扰特异基因的表达。

   miRNA(单链微小RNA)

由发夹状结构经酶切后以双链形式存在,最后释放互补链,获得成熟链后可与mRNA互补下调基因表达。

     shRNA(短发夹RNA)

人工构建至U6/H1或CMV启动子的shRNA载体中,利用细胞内的酶切机制得到siRNA


Q:我只确定了靶基因,没有任何靶点的情况下如何开展RNAi工作?

A在未知靶点的情况下,我们可以为客户的靶基因设计四个干扰靶点,并进行shRNA干扰载体的构建工作。构建好的干扰载体,常规采用转染效率高的293T细胞进行干扰筛选,若靶基因在293T细胞表达丰度高可直接进行筛选;若靶基因表达丰度过低则需要构建靶基因的真核表达载体与干扰质粒共转染293T细胞后进行筛选。


Q:为何要进行293T细胞中靶基因的表达丰度检测?

A我们对293T细胞的靶基因表达丰度进行qPCR相对定量分析以确定后续的干扰筛选方式;如果靶基因与内参基因的Ct值小于7则认为表达丰度较高,可以进行293T细胞的内源筛选实验;反之则建议构建真核表达载体与干扰质粒共转染293T细胞后进行筛选。


Q:贵公司能否保证RNAi靶点的干扰效率?

A针对人、大鼠、小鼠设计的4个干扰靶点中,我们保证在转染效率大于80%的情况下,qPCR检测有1个靶点的干扰效果不小于70%。


Q:不同细胞中表达同一干扰片段对靶基因的沉默效果会有差异吗?

A会有差异:

1) 干扰片段所对应的目的mRNA的位点上可能有蛋白结合导致干扰片段无法接近目的序列,不同细胞结合蛋白的多少可能不一样从而影响沉默效果。

2) 不同细胞目的mRNA的表达含量不一样可能导致沉默效果会有差异。

3) Dicer、Drosha以及运输RNAi加工中间体出核或者入核的蛋白和RISC复合物表达量会在不同细胞中有所差异。

4) 不同细胞中CMV启动子活性可能不同,导致其表达量会有差异。


Q:可否直接提供靶细胞进行干扰效率筛选工作?

A目的基因表达丰度高的靶细胞若转染效率可达到80%以上可以进行shRNA质粒的干扰筛选工作,若转染效率过低,则建议在293T细胞中进行筛选,或者包装干扰病毒液感染靶细胞进行筛选工作。


Q:针对人类基因设计的感染靶点对小鼠是否也有效?

A由于设计好的干扰靶点要求与靶基因序列完全互补配对,故大部分干扰靶点无法满足两个物种基因沉默的效果。即便是针对不同物种的同源基因的相同片段,由于基因在不同物种中表达有差异,也会导致不同的基因沉默效果,因此要进行靶点验证工作。


参考文献

1. 1 Sui G, Soohoo C, Affar EB, et al. A DNA vector-based R N A i technology to suppress gene expression in mammaliancells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002,99(8):5515-5520.

2.Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering R NAs in mammsliancells. Science 2002 296(5567):550-553.

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