锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

siRNA的细胞转染及筛选

Cell transfection and screening



实验原理


继植物中发现基因沉默现象后,动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明,并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定,足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA(Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA,由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内,在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。


技术应用


基因功能的体内外研究

RNAi类药物研发


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

靶细胞

目的基因NCBI登陆号、靶细胞培养条件

4周

我们提供

剩余siRNA

基本实验步骤、细胞照片、 qPCR原始数据,扩增曲线,熔解曲线


实验结果展示


   图1 相对定量 PCR 检测 3 组 siRNA 转染组相对阴性对照组目的基因的干扰效果


TROUBLESHOOTING


实验问题

原因

推荐解决方法

荧光标记的阴性对照siRNA无可见荧光?

转染效率不高

保证细胞状态良好;选择合适的转染试剂,调整转染试剂siRNA的比例;避免培养基中含有抗生素;适当延长观察时间。

siRNA转染实验阳性对照和靶基因均无干扰效果?

转染体系

提高转染效率,模式siRNA的使用浓度,注意实验操作防止RNA每污染。

阳性对照有效而靶基因的siRNA转染无干扰效果?

干扰靶点无效

设计多对siRNA片段进行尝试,选择干扰效率最高的靶点。

同一对siRNA在不同细胞中干扰效果不同?

不同细胞特性不同

转染效率相近,不同细胞核酸酶的活性高低也会影响siRNA的代谢速度,导致沉默效果出现差异。

本底表达丰度不同

本底表达丰度很高或很低对干扰效果都有影响。

转染效率不同

优化转染方式,提高转染效率。


常见问题FAQ


Q:化学合成siRNA的结构?

A:化学合成的siRNA为正义链和反义链双链结构,正义链与靶序列相同,通常为19个核苷酸。另外正义链和反义链的3‘端均含有dTd的悬垂,脱氧核糖核苷可保护siRNA免受降解。客户未有验证靶点的情况下建议一次合成3对以上的siRNA进行筛选工作。


Q :化学合成的siRNA有哪些可选种类?特点有哪些?

种类

特点

化学合成siRNA

无修饰和荧光标记,合成方便快捷,价格便宜。

化学修饰siRNA

对正义链进行化学修饰更加稳定,延长了作用时间。

荧光标记siRNA

对正义链进行荧光标记(如CYC3)后可通过观察荧光优化转染条件,也便于对siRNA进行定位追踪。


Q:细胞转染实验的siRNA推荐浓度是多少?

A:细胞转染实验的终浓度建议采用50-100NM,浓度过高导致细胞毒性。对于21bp的siRNAoligo,有如下简单关系:20D=6.0nmol=80ug。一般购买20D包装的siRNA,可采用DEPC水配成母液后使用前稀释。


Q:实验中采用阴性对照和阳性对照siRNA的目的?

A:由于高浓度的siRNA有可能导致非常异性的干扰结果,因此必须设置阴性对照,建议使用通过的带有荧光标记的阴性对照siRNA;将靶序列打乱之后的阴性对照siRNA,未经验证,有可能引起off-target现象。阳性对照可以确保实验中的操作无误,如转染操作,RNA抽提方法以及qPCR检测结果都是可信的。


Q:化学合成的siRNA靶点序列将来可否用于构建shRNA质粒载体和病毒包装?

A:已确认干扰效果的siRNA靶点可以进行shRNA质粒载体的构建个病毒包装工作,但毕竟表达体系不同可能存在一定的风险,干扰效果会有一定的差异。建议构建好shRNA质粒载体后进行干扰效果的验证工作。


参考文献

1.Paul CP, Good PD Winer l Effectie expression of small interfering R NA in human cells. Nature Biotechnology2002,20(5):505-508.

2.Ladunga I. More complete gene silencing by fewer siR NAs: transparent optimized design and biophysical signatuse. Nucleic Res 2007,35(2):433-440.

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