锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

质粒载体构建

vector construction



实验原理


质粒载体可以有效地运载外源基因片段进入受体细胞,可以独立自主大量复制并且很容易从宿主细胞中分离纯化,因而在分子生物学使用十分广泛。常用的载体可分为克隆载体和表达载体,根据载体进入受体细胞的不同,分为原核细胞表达载体、真核细胞表达载体以及穿梭载体。


技术应用


目的基因的表达研究

基因、蛋白的功能研究


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

非常用的质粒载体

目的基因NCBI登录号、载体图谱

3周

我们提供

质粒/菌株

基本实验步骤、电泳图片、测序报告


实验结果展示


A                                                            B

    图1 目的基因的载体构建电泳图

A:目的片段的菌落PCR鉴定结果(泳道1-5:1-5号克隆的菌落PCR鉴定结果,其中1-3号样本为菌落PCR阳性样本,4-5号样本为菌落PCR阴性样本;泳道6:阳性对照;泳道7:阴性对照)。

B:目的片段的酶切电泳结果(目的片段的酶切电泳结果,载体片段5300bp,目的片段820bp)。


TROUBLESHOOTlNG


实验问题

原因

推荐解决方法

连接转化后平板上全部为阴性克隆?

连接效率

优化目的片段与载体片段的比例,载体片段的摩尔数过高导致阴性克隆增多。

连接转化后平板上无克隆?

感受态度细胞效率不高

重新制备新鲜的感受态细胞或购买商品化的感受细胞。

连接体系

增加目的片段与载体片段的摩尔数。

收到的质粒转染效率很低?

质粒纯度

提供的10ug小抽质粒适用于分子生物学实验,其纯度及浓度都不适合用于细胞转染,需客户进行高纯度的质粒抽提工作。

细胞难转染

在保证细胞状态良好的条件下,摸索合适的转染试剂以及转染条件。

过表达质粒成功转染后WB未见明显表达?

蛋白功能

过量表达的蛋白对宿主细胞可能有毒性作用。



常见问题 FAQ


Q:如何看懂一个载体的质粒图谱?

A1)首先明确载体的功能是克隆载体还是表达载体,表达载体含有启动子、终止等序列,原核表达载体常用T7启动子、真核表达载体载体常用CMV启动子。2)明确多克隆位点(MCS)有哪些酶切位点可用,插在该区域的外源基因可以像载体中的正常序列一样进行复制和扩增。3)方便的筛选标记,原核抗性如氨、卡那,真核抗性如新霉素、嘌呤霉素。4)有哪些荧光标记或蛋白标签序列。5)注意是否有其他功能元件。


Q :方便追踪目标基因表达的GFP的常见真核表达载体有哪几种,各有说明区别?

A可以提供pEGFP-C1和pIES2-EGFP三种载体选择(EGFP中E代表Enhanced即经过改造的GFP,荧光强度得到加强,表达效率更高)。前两种为EGFP的融合表达载体,分别在目的基因的N端和C端进行融合表达,后一种为目的基因与EGFP共表达的载体。


Q :酶切连接有哪些种类?

酶切连接分类

要求

连接结果

粘性末端连接

双酶切连接

对酶切片段切胶回收

外原片段可定向插入,阳性克隆率高

单酶切连接

载体线性化后需磷酸酶脱磷出来

外源片段会以正反两个方向插入载体,可能出现串联拷贝

平末端连接

采用高浓度的连接酶,注意载体和目标片段的比例,可加入PEG4000等凝聚剂

可能出现串联拷贝,连接效率低,注意增加连接酶量和连接时间


Q:plRES2-EGFP载体中的IRES序列的作用是什么?

AIRES序列的全称是内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Site),一般真核mRNA的翻译都需要5‘帽子来介导核糖体结合。微小RNA病毒家族则外例外,这类病毒在其mRNA前没有帽子位点,但却有600-1200bp的5‘非翻译区,其中含有多个非起始AUG,这段长的非翻译区即叫做IRES序列。IRES能招募核糖体对mRNA进行翻译。在同一启动子下,将目的基因(注意要加终止子后加IRES及EGFP序列,IRES后的EGFP就能独立地起始翻译,可与目的基因共表达的作用,但表达量要低于目的基因,GFP荧光剂有可能会较弱。


Q:重组克隆的筛选鉴定方法有哪些?

鉴定名称

具体方案

抗性筛选

采用含氨苄、卡那抗性的平板或培养基培养

菌落PCR

以少量菌液作为模板采用特定引物扩增检测是否能够扩增到目标片段

酶切鉴定

电池判断酶切获得目的的片段大小

测序鉴定

确定序列中每一个碱基与预期一致


参考文献

1. J e a n Pe c c o u d. G e n e  S y n t h e s i s: M e t h o d s and Protocols. Humana Press,2012.

2. Benjamin Lewin. Genes IX [M]. Pearson Education,2007.

QQ客服
 
 
 工作时间
周一至周五 :9:00-18:00
 皇冠赌场方式
客服热线:13761475994 (肖经理)
邮箱:service@research-bio.com
注:不用QQ的可点击网页右侧按钮在线咨询

沪公网安备 31011502005995号