锐赛生物
靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体检测激酶检测体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示QPCRWB检测ELISA检测甲基化检测SNP检测高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8检测流式周期检测流式凋亡检测流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)检测线粒体膜电位检测transwell检测管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光检测稳转株构建双荧光素酶检测细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)检测酶活动力学检测HDA检测细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学检测服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务u.cad癌症筛查检测全外显子组基因检测其他疾病基因检测生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡检测自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料公司新闻案例库漂亮SCI科研转化成果价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板皇冠赌场我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助促销活动

目的基因ORF克

ORF cloning



实验原理


ORF 克隆是指从样本组织或细胞中抽提总 RNA,反转录,设计合成特异性引物后,通过 RT-PCR 扩增获得目的基因的 DNA 序列,获得编码全长蛋白质序列的 DNA 序列:即从起始密码 ATG 到终止密码子,不含 5′ 3′UTRs 非翻译区)及内含子序列。


技术应用


目的基因的表达研究

基因、蛋白的功能研究


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

目的基因表达丰富高的组织或细胞样本

目的基因NCBI登录号

4周

我们提供

质粒/菌株

基本实验步骤、电泳图片、测序报告


实验结果展示


                  A                                                       B                                                              C


1 目的基因的ORF克隆实验结果

A:样本1和样本2的RNA抽提电泳结果 ;B 不同扩增条件下目的片段的PCR扩增结果;C 目的片段酶切鉴定结果(T载体片段2692bp,目的片段1100bp)。



TROUBLESHOOTLNS


实验问题

原因

推荐解决方法

RT-PCR 未能扩增目的条带?

RNA 的抽提质量

严格按照标准RNA抽提步骤进行

基因表达丰度

目的基因的本底表达丰度是否过低,考虑更换表达丰度更高的组织细胞样本。

复杂基因结构

基因序列中存在复杂的二级结构,GC 含量过高,串联重复序列都可能导致扩增失败。


RT-PCR 扩增非特异性条带过多?


PCR 反应条件

建议提高退火温度

RT-PCR 扩增目标带过弱?

PCR 反应条件

建议增加 DNA 聚合酶的量或镁离子浓



常见问题FAQ


Q:我怎样获得含有母的基因序列的质粒呢?

A :明确目的基因的种属和基因的 NCBI 登录号后,如果想通过调取的方式获得则需要了解该基因在哪些组织或细胞中表达丰度较高,即通过 ORF 克隆获得蛋白翻译序列,然后构建至质粒中;若基因表达丰度低,难于调取可以考虑通过化学合成,即合成长片段引物,分段扩增拼接得到全长序列然后构建至质粒中。


Q : ORF 克隆服务若需客户提供材料需要哪些注意事项?

A :通常我们可从公司的常见肿瘤细胞和正常组织的 cDNA 库进行调取工作。若客户提供高表达目的基因的特定组织或细胞,请注意实验材料必须保证新鲜,即采样后需立即放入液氮中速冻或研磨加Trizo保护液,保证RNA 无明显降解,组织样本提供总量大于 50mg,细胞样本总量大于 1*10^5


Q:收到的质粒和菌株如何保存?

A:收到的质粒和菌株如需长期保存请置于 -80 ℃,菌株活化可以通过平板划线后,挑取单克隆过夜摇菌。一般质粒较菌株更加稳定,若菌株已无法活化,可以将质粒转化大肠杆菌,重新保存菌株,并可以抽提更多质粒以进行后续的实验工作。


Q: cDNA 克隆与 ORF 克隆的区别是什么

A:cDNA克隆比ORF克隆多了5′或3′UTRs序列。注意5’UTR序列可能会形成复杂二级结构,影响基因的表达效率,因此一般采用 ORF 克隆进行表达研究。


Q:调取出来的序列与NCBI上相同基因名称的序列比对时,发现两者间有一定程度上的差异,如何解释?

A:由于编码基因的多选择性剪接,一个基因通常会有多个转录产物(通常是长短的差异),因此可通过文献确定最具有代表性的转录本;另外由于调取样本的来源导致的基因遗传多态性,会出现一些有义或无义的突变。我们可以通过比较多个克隆的测序结果确认这些突变并非是由于 PCR 引入的。如果酶的保真度出现问题,出现的点突变会是随机发生的,不可能在每个克隆的同一位点发生相同的突变。无义突变不会影响蛋白的翻译序列,一般可以接受。若怀疑有义突变会影响到蛋白功能就需要进行突变修复工作。


参考文献

1. Joseph Sambrook, E. F. Fritsch,Tom Maniatis. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

2. Benjamin Lewin. Genes lx [M]. Pearson Education,2017.

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